Антибактериальные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus
Грязнева Т.Н., доктор биологических наук, Почетный член Национального Союза «Медико-биологическая защита».
Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus. Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическими пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте людей и животных.
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.
Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.
В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др.). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств.
В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ №2335 и B. licheniformis ВКПМ №2336.
Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).
Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.
В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин+тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.
Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.
Таблица1
Антибиотики, продуцируемые B. subtilis
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracis и B.cereus), как правило, являются безвредными для организма даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.
Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.
В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др.). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств.
В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ №2335 и B. licheniformis ВКПМ №2336.
Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).
Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.
В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин+тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.
Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.
Таблица1
Антибиотики, продуцируемые B. subtilis
Образование антибиотиков происходит обычно в логарифмической фазе роста для многих продуцентов, однако для спорообразующих бактерий свойственны и другие сроки их продукции.
Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; влияние репресси и на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.
Снижение синтеза антибиотика бациллами обусловлено некатаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO3. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.
Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептидных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.
Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование названных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: аминокислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость
— центрифугат культуральной жидкости.
Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделяются наследующие классы:
— основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;
— циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;
— линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран — грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК — например,тиротрицин;
— аминогликозидные антибиотики—бутирозин.
В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбиформин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49- 4,6633, 26а, В-456,3, бацилломицин.
Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В1957 г. из культуры выделены два антибиотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, которые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.
Aspergillus-фактор—антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное действие на различные виды грибов и дрожжей.
Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans — в дозе 8,1мкг/мл; R.solani — 0,4; S.bataticola — 3,5; S.fructicola — 5,9; P.digitatum — 6,2; A.niger — 9,9; B.cinerea — 4,8мкг/мг.
Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действиена M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.
Бацилизин — антибиотик,который также, как ибацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.
Бацилломиксин — антибиотический комплекс, описанный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.
Бацилломицин — антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против патогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.
Бациллин — антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г.
Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterellasp.). Введение бациллина мышам внутри брюшин но в дозе до 1000 мг/кг невызывает патологических изменений.
Ксантелин получен в 1951 г. Подавляет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.
Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый культурами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высоко активен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл — S.fructicola, в дозе 3,75мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл — нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.
Микобациллин выделен и описан в 1958.В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов — возбудителей некоторых болезней растений.
Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosisavium.
Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериальную активность в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.
Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningitis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.
Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганизмы.
Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Представляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.
Ризостониа-фактор получен из культуры В.subtilis 6633. Описан в 1949г.
Характеризуется избирательной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая используется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans — 160, R.solan i— 45, S.bataticola — 64, S.fructicola —14, P.digitatum — 68, B.cinerea — 6,4мкг/мл.
Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естественного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.
Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5 - 22,5 мкг/мл — Pasteureullasp.; в дозе 140-200 мкг/мл — S.aureus; 165 мкг/мл — S.typhi.
Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е.coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, P asteurellasp. в дозах 20—50мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.
Субспорин — комплекс антибиотических веществ, образуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую антибиотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.
Токсимицин получен в 1952 г. в виде концентрата. Проявляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.
Трипанотоксин, выделенный в 1911г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.
Фунгистатин (синоним — антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отношении некоторых грибов, патогенных для человека, животных и растений. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.
Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиотическим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсорбируется на активированном угле. Не инактивируется пепсиномилитрипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100 Д.
Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.
Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в больших дозах —S.haemolyticus и M.tuberculosis.
Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибиотическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.
Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотикTL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.
В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о полипептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика — В.subtilis 26a – был изолирован из кишечника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и не идентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе развития культуры —в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.
Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3мкг/мл. Поспе к тру антимикробного действия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.
В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезируемый культурой В.subtilisTL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 — 800 Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибиотика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.
Антибиотик 61-26 образуется культурой В.subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактонилиэфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200 Д. Содержит следующие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валини и золейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамположительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патогенные для человека и животных.
В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штамма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotrisalternans Bonordи Dendrodochiumtoxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps.aeruginosa, В.anthracis, C.albicans. Согласно предварительным данным о химической природе антибиотика, это — низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.
Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борьбы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachybotris alternans и Dendrodochiumtoxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспензии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды. Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotrisalternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба снижается в зависимости от продолжительности и контактами кромицета с антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц — в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.
Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.
Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; влияние репресси и на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.
Снижение синтеза антибиотика бациллами обусловлено некатаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO3. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.
Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептидных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.
Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование названных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: аминокислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость
— центрифугат культуральной жидкости.
Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделяются наследующие классы:
— основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;
— циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;
— линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран — грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК — например,тиротрицин;
— аминогликозидные антибиотики—бутирозин.
В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбиформин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49- 4,6633, 26а, В-456,3, бацилломицин.
Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В1957 г. из культуры выделены два антибиотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, которые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.
Aspergillus-фактор—антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное действие на различные виды грибов и дрожжей.
Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans — в дозе 8,1мкг/мл; R.solani — 0,4; S.bataticola — 3,5; S.fructicola — 5,9; P.digitatum — 6,2; A.niger — 9,9; B.cinerea — 4,8мкг/мг.
Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действиена M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.
Бацилизин — антибиотик,который также, как ибацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.
Бацилломиксин — антибиотический комплекс, описанный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.
Бацилломицин — антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против патогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.
Бациллин — антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г.
Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterellasp.). Введение бациллина мышам внутри брюшин но в дозе до 1000 мг/кг невызывает патологических изменений.
Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов,неактивен в отношении бактерий. Природа этого антибиотика неизучена.
Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.
Датемицин — антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.
Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных грибов.
Истеидин—антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.
Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г.
Антибиотик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие итурин оказывает на грибы, в том числе, напатогенные для человека и животных.Ксантелин получен в 1951 г. Подавляет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.
Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый культурами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высоко активен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл — S.fructicola, в дозе 3,75мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл — нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.
Микобациллин выделен и описан в 1958.В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов — возбудителей некоторых болезней растений.
Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosisavium.
Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериальную активность в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.
Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningitis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.
Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганизмы.
Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Представляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.
Ризостониа-фактор получен из культуры В.subtilis 6633. Описан в 1949г.
Характеризуется избирательной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая используется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans — 160, R.solan i— 45, S.bataticola — 64, S.fructicola —14, P.digitatum — 68, B.cinerea — 6,4мкг/мл.
Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естественного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.
Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5 - 22,5 мкг/мл — Pasteureullasp.; в дозе 140-200 мкг/мл — S.aureus; 165 мкг/мл — S.typhi.
Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е.coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, P asteurellasp. в дозах 20—50мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.
Субспорин — комплекс антибиотических веществ, образуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую антибиотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.
Токсимицин получен в 1952 г. в виде концентрата. Проявляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.
Трипанотоксин, выделенный в 1911г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.
Фунгистатин (синоним — антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отношении некоторых грибов, патогенных для человека, животных и растений. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.
Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиотическим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсорбируется на активированном угле. Не инактивируется пепсиномилитрипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100 Д.
Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.
Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в больших дозах —S.haemolyticus и M.tuberculosis.
Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибиотическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.
Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотикTL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.
В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о полипептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика — В.subtilis 26a – был изолирован из кишечника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и не идентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе развития культуры —в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.
Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3мкг/мл. Поспе к тру антимикробного действия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.
В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезируемый культурой В.subtilisTL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 — 800 Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибиотика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.
Об антибиотике В-456, образуемом В.subtilis, сообщил в1956г. Tanaka. Этот антибиотик представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин.Обладает противогрибным действием.
Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность фракций различалась. Первая наиболее активна в отношении Neurosporacrassa; вторая —Penicilliumchrysogenum, третья—Trichophytontonsurans. Все три выделенные антибиотические вещества —полипептиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в них пролина.Антибиотик 61-26 образуется культурой В.subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактонилиэфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200 Д. Содержит следующие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валини и золейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамположительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патогенные для человека и животных.
В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штамма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotrisalternans Bonordи Dendrodochiumtoxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps.aeruginosa, В.anthracis, C.albicans. Согласно предварительным данным о химической природе антибиотика, это — низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.
Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борьбы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachybotris alternans и Dendrodochiumtoxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспензии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды. Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotrisalternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба снижается в зависимости от продолжительности и контактами кромицета с антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц — в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.
Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.
Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ
По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов различных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разнообразных субстратах.Таблица 2
Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus
У бацилл особенно хорошо развита система гидролаз — ферментов, катализирующих реакции гидролитического расщепления молекул. Среди гидролаз практический интерес представляют протеолитические ферменты, составляющие особый подкласс пептид-гидролаз.
Основной функцией протеолитических ферментов является расщепление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными ферментами.
Внеклеточные протеазы, кроме основных функций — катализа гидролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разложении вегетативного клеточного материала для последующего использования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.
Инициация споруляции обусловлена расщеплением внеклеточной сериновой протеазой β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и превращению в РНК-полимераз у спорулирующих клеток.
Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается способностью продуцировать протеазу. Высказывается предположение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.
Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются В.subtilis и В.mesentericus.
Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и со-авт. (1974), 860 расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распространено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.
У В.subtilis и В.mesentericus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых связей фибрина.
Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на ранних этапах споруляции, раньше, чем протеазы в культуральной жидкости. Установлена тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спор у лирующих бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической посттрансляционной модификации белков.
С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, установлена их гомологичность, что подтверждает родство этих двух видов.
Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов —сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I–23000-24000Д, II—29000Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.
Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтральные порН-оптимуму их действия. Значительно реже у них обнаруживаются кислые протеазы. Наиболее известны и хорошо изучены щелочные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В (Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В.subtilis.
Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптимумом действия при рН 10,5-11,0 и температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.
В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.
Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких компонентов. По скорости движения на электрофореграммах протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из которых отнесены к субтилизинам.
Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только в виду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяйстве, медицине и ветеринарии.
Протеолитические ферменты используют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовления питательных сред; в биохимии для теоретических исследований и др.
Протеазы внедряются в ветеринарную практику и медицину для лечения воспалительных процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.
Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты. В.subtilis – это первый микроорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов. Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комплекс, состоящий из ферментов с различной субстратной специфичностью. Они делятся на две группы: ферменты, участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов.
Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.
Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для производства амилосубтилина, в животноводстве — для улучшения качества кормового белка, в медицине — в качестве антимикробных агентов, а также — в теоретических исследованиях для расшифровки структуры клеточных стенок микроорганизмов.
Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, которые можно использовать для получения глюкозы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток. Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, которая используется в пищевой промышленности.
Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и В.amyloliqulfaciens.
Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.
Практическое применение находят пектиназа — для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) — в медицине и фармацевтической промышленности.
Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок хранения ферментов и перейти к непрерывным технологическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора против белкового помутнения.
Оказалось возможным иммобилизовать не только ферменты, но и живые клетки, которые в этом состоянии способны осуществлять ферментативные реакции в течение длительного времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с сохранением иммобилизованными клетками активности α-амилазы.
Благодаря высокой биохимической активности, многообразию метаболических путей аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных токсических соединений и могут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей среды.
Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в крупномасштабном производстве. Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образуют лизин, 21,5% штаммов — фенилаланин, 7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов — триптофан.
По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus, 31 образовывал аргинин, 30 — лизин, 26 — лейцин, 26 — аспарагин.
Валин в наибольших количествах накапливается в культурах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.
Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами, что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных для гидрометаллургии условиях.
Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.
У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный белок. Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов, широко используемых в пищевой промышленности в качестве приправ, а также в медицине для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.
Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в течение 60-72 ч инозита — до 11,65 г/л, гипоксантина — до 2,05 г/л, гуанозина — до 15-16 г/л. Эти штаммы используются для получения нуклеотидов путем управляемой ферментации, в том числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.
Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis, В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В12 у бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.
Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные из ризосферы, продуцируют витамин В12 — до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.
Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов — тиамина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.
Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В6 (2-5 мг/л), рибофлавин и др.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности бактерий рода Bacillus и широком спектре синтезируемых ими веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии, медицины и ветеринарии.
Основной функцией протеолитических ферментов является расщепление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными ферментами.
Внеклеточные протеазы, кроме основных функций — катализа гидролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разложении вегетативного клеточного материала для последующего использования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.
Инициация споруляции обусловлена расщеплением внеклеточной сериновой протеазой β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и превращению в РНК-полимераз у спорулирующих клеток.
Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается способностью продуцировать протеазу. Высказывается предположение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.
Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются В.subtilis и В.mesentericus.
Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и со-авт. (1974), 860 расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распространено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.
У В.subtilis и В.mesentericus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых связей фибрина.
Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на ранних этапах споруляции, раньше, чем протеазы в культуральной жидкости. Установлена тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спор у лирующих бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической посттрансляционной модификации белков.
С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, установлена их гомологичность, что подтверждает родство этих двух видов.
Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов —сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I–23000-24000Д, II—29000Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.
Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтральные порН-оптимуму их действия. Значительно реже у них обнаруживаются кислые протеазы. Наиболее известны и хорошо изучены щелочные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В (Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В.subtilis.
Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптимумом действия при рН 10,5-11,0 и температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.
В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.
Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких компонентов. По скорости движения на электрофореграммах протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из которых отнесены к субтилизинам.
Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только в виду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяйстве, медицине и ветеринарии.
Протеолитические ферменты используют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовления питательных сред; в биохимии для теоретических исследований и др.
Протеазы внедряются в ветеринарную практику и медицину для лечения воспалительных процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.
Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты. В.subtilis – это первый микроорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов. Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комплекс, состоящий из ферментов с различной субстратной специфичностью. Они делятся на две группы: ферменты, участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов.
Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.
Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для производства амилосубтилина, в животноводстве — для улучшения качества кормового белка, в медицине — в качестве антимикробных агентов, а также — в теоретических исследованиях для расшифровки структуры клеточных стенок микроорганизмов.
Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, которые можно использовать для получения глюкозы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток. Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, которая используется в пищевой промышленности.
Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и В.amyloliqulfaciens.
Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.
Практическое применение находят пектиназа — для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) — в медицине и фармацевтической промышленности.
Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок хранения ферментов и перейти к непрерывным технологическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора против белкового помутнения.
Оказалось возможным иммобилизовать не только ферменты, но и живые клетки, которые в этом состоянии способны осуществлять ферментативные реакции в течение длительного времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с сохранением иммобилизованными клетками активности α-амилазы.
Благодаря высокой биохимической активности, многообразию метаболических путей аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных токсических соединений и могут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей среды.
Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в крупномасштабном производстве. Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образуют лизин, 21,5% штаммов — фенилаланин, 7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов — триптофан.
По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus, 31 образовывал аргинин, 30 — лизин, 26 — лейцин, 26 — аспарагин.
Валин в наибольших количествах накапливается в культурах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.
Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами, что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных для гидрометаллургии условиях.
Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.
У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный белок. Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов, широко используемых в пищевой промышленности в качестве приправ, а также в медицине для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.
Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в течение 60-72 ч инозита — до 11,65 г/л, гипоксантина — до 2,05 г/л, гуанозина — до 15-16 г/л. Эти штаммы используются для получения нуклеотидов путем управляемой ферментации, в том числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.
Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis, В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В12 у бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.
Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные из ризосферы, продуцируют витамин В12 — до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.
Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов — тиамина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.
Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В6 (2-5 мг/л), рибофлавин и др.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности бактерий рода Bacillus и широком спектре синтезируемых ими веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии, медицины и ветеринарии.
Антибактериальные вещества, продуцируемые бактериями рода Bacillus
Перспективным направлением в конструировании и совершенствовании пробиотиков является применение бактерий рода Bacillus. Эти микроорганизмы широко распространены в природе, являются устойчивыми к литическими пищеварительным ферментам, длительно сохраняют жизнеспособность в желудочно-кишечном тракте людей и животных.
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracisиB.cereus),как правило, являются безвредными для организма даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.
Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.
В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств.
В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ №2335 и B. licheniformis ВКПМ №2336.
Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).
Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.
В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин+тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.
Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.
Таблица1
Антибиотики, продуцируемые B. subtilis
Среди различных представителей экзогенной микрофлоры, бациллы характеризуются рядом преимуществ, которые позволяют считать их наиболее эффективными в качестве основы новых пробиотиков. Эти бактерии (кроме B.anthracisиB.cereus),как правило, являются безвредными для организма даже в высоких концентрациях; обладают антагонистической активностью к широкому спектру патогенных и условно патогенных микроорганизмов; характеризуются высокой ферментативной активностью, что может обусловить существенное регулирование и стимулирование пищеварения; способны оказывать противоаллергенное и антитоксическое действие; технологичны в производстве и стабильны при хранении.
Важная особенность бацилл состоит в том, что хорошо изучена их генетика и поэтому они являются перспективной системой для клонирования чужеродных генов.
В настоящее время методами генетической инженерии на основе аэробных спорообразующих бактерий получены суперпродуценты различных биологически активных веществ (колицин Е2 и др). Это открывает перспективу конструирования на основе бацилл штаммов с заданными свойствами и использования их новых свойств.
В 90-х годах прошлого века в медицинской практике проводились широкие испытания препарата «Биоспорин», созданного сотрудниками института микробиологии и вирусологии им. Д.К.Заболотного НАН Украины, на основе штаммов B.subtilis ВКПМ №2335 и B. licheniformis ВКПМ №2336.
Было установлено, что «Биоспорин» более эффективен по сравнению не только с пробиотиками из представителей нормального микробиоценоза желудочно-кишечного тракта (типа бифидумбактерина, лактобактерина или колибактерина), но и в сравнении с препаратами на основе монопрописей спорообразующих бактерий (бактисубтил, споробактерин).
Количество известных антибиотиков, продуцируемых спорообразующими аэробными бактериями, в настоящее время приближается к 200. По количеству продуцируемых антибиотических веществ микроорганизмы рода Bacillus уступают лишь актиномицетам.
В доступной литературе описано более 70 различных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus. Некоторые из них уже широко применяются в медицине, ветеринарии, сельском хозяйстве, пищевой промышленности и др. Это полимиксины, колистин, бацитрацин, тиротрициновый комплекс (линейный грамицидин+тироцидин), грамицидин С, субтилин, эдеин, бутирозин.
Большинство идентифицированных антибиотиков, продуцируемых бактериями рода Bacillus – пептиды, вместе с тем, в последние годы все больше сообщений свидетельствуют о том, что представители данной группы микроорганизмов продуцируют антибиотические вещества, относящиеся и к другим классам соединений.
Таблица1
Антибиотики, продуцируемые B. subtilis
Грязнева Т.Н., доктор биологических наук, Почетный член Национального Союза «Медико-биологическая защита».
Образование антибиотиков происходит обычно в логарифмической фазе роста для многих продуцентов, однако для спорообразующих бактерий свойственны и другие сроки их продукции.
Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; влияние репресси и на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.
Снижение синтеза антибиотика бациллами обусловлено некатаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO3. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.
Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептидных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.
Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование названных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: аминокислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость
— центрифугат культуральной жидкости.
Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделяются наследующие классы:
— основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;
— циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;
— линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран — грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК — например,тиротрицин;
— аминогликозидные антибиотики—бутирозин.
В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбиформин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49- 4,6633, 26а, В-456,3, бацилломицин.
Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В1957 г. из культуры выделены два антибиотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, которые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.
Aspergillus-фактор—антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное действие на различные виды грибов и дрожжей.
Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans — в дозе 8,1мкг/мл; R.solani — 0,4; S.bataticola — 3,5; S.fructicola — 5,9; P.digitatum — 6,2; A.niger — 9,9; B.cinerea — 4,8мкг/мг.
Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действиена M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.
Бацилизин — антибиотик,который также, как ибацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.
Бацилломиксин — антибиотический комплекс, описанный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.
Бацилломицин — антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против патогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.
Бациллин — антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г.
Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterellasp.). Введение бациллина мышам внутри брюшин но в дозе до 1000 мг/кг невызывает патологических изменений.
Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов,неактивен в отношении бактерий. Природа этого антибиотика неизучена.
Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.
Датемицин — антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.
Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных грибов.
Истеидин—антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.
Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г.
Антибиотик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие итурин оказывает на грибы, в том числе, напатогенные для человека и животных.
Ксантелин получен в 1951 г. Подавляет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.
Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый культурами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высоко активен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл — S.fructicola, в дозе 3,75мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл — нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.
Микобациллин выделен и описан в 1958.В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов — возбудителей некоторых болезней растений.
Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosisavium.
Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериальную активность в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.
Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningitis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.
Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганизмы.
Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Представляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.
Ризостониа-фактор получен из культуры В.subtilis 6633. Описан в 1949г.
Характеризуется избирательной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая используется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans — 160, R.solan i— 45, S.bataticola — 64, S.fructicola —14, P.digitatum — 68, B.cinerea — 6,4мкг/мл.
Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естественного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.
Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5 - 22,5 мкг/мл — Pasteureullasp.; в дозе 140-200 мкг/мл — S.aureus; 165 мкг/мл — S.typhi.
Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е.coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, P asteurellasp. в дозах 20—50мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.
Субспорин — комплекс антибиотических веществ, образуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую антибиотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.
Токсимицин получен в 1952 г. в виде концентрата. Проявляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.
Трипанотоксин, выделенный в 1911г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.
Фунгистатин (синоним — антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отношении некоторых грибов, патогенных для человека, животных и растений. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.
Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиотическим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсорбируется на активированном угле. Не инактивируется пепсиномилитрипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100 Д.
Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.
Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в больших дозах —S.haemolyticus и M.tuberculosis.
Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибиотическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.
Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотикTL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.
В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о полипептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика — В.subtilis 26a – был изолирован из кишечника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и не идентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе развития культуры —в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.
Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3мкг/мл. Поспе к тру антимикробного действия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.
В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезируемый культурой В.subtilisTL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 — 800 Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибиотика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.
Об антибиотике В-456, образуемом В.subtilis, сообщил в1956г. Tanaka. Этот антибиотик представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин.Обладает противогрибным действием.
Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность фракций различалась. Первая наиболее активна в отношении Neurosporacrassa; вторая —Penicilliumchrysogenum, третья—Trichophytontonsurans. Все три выделенные антибиотические вещества —полипептиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в них пролина.
Антибиотик 61-26 образуется культурой В.subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактонилиэфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200 Д. Содержит следующие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валини и золейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамположительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патогенные для человека и животных.
В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штамма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotrisalternans Bonordи Dendrodochiumtoxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps.aeruginosa, В.anthracis, C.albicans. Согласно предварительным данным о химической природе антибиотика, это — низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.
Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борьбы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachybotris alternans и Dendrodochiumtoxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспензии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды. Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotrisalternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба снижается в зависимости от продолжительности и контактами кромицета с антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц — в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.
Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.
Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ
По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов различных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разнообразных субстратах.
Таблица 2
Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus
Образование пептидных антибиотиков у бацилл контролируется азотной и углеродной репрессией; влияние репресси и на эти процессы может изменять взаимосвязь между характером роста культур и количеством образуемых антибиотиков.
Снижение синтеза антибиотика бациллами обусловлено некатаболитной репрессией углеродом, а изменением рН среды, вызванным микробным метаболизмом. Этот вывод базировался на обратном эффекте, наблюдаемом при добавлении в питательную среду CaCO3. В дальнейшем установлено, что подавление синтеза антибиотика определяется не изменением pH среды, а образованием из глюкозы органических кислот (уксусной и пировоградной). Их нейтрализация снимает ингибирование синтеза антибиотиков.
Таким образом, пептидные антибиотики синтезируются бациллами-продуцентами в стадии активного роста. Расшифровка механизмов продукции антибиотиков способствует прогрессу исследований, связанных с внеклеточным синтезом пептидных антибиотиков. Внеклеточный синтез грамицидина, тироцидина, грамицидина линейного, эдеина, бацитрацина, колистина и микобациллина детально освещен в работах ученых в 70-х годах 20 века.
Биосинтетические системы бацилл, в которых происходит образование названных выше полипептидных антибиотиков, отличаются от систем, в которых синтезируется белок. Необходимые условия для синтеза антибиотика включают, как правило, следующие компоненты: аминокислоты, аденозин-5-трифосфат, ионы магния, редуцирующий агент и свободную от клеток надосадочную жидкость
— центрифугат культуральной жидкости.
Синтезируемые бактериями рода Bacillus антибиотики подразделяются наследующие классы:
— основные пептиды (например, эдеин), подавляющие образование 30S-рибосомальных комплексов и ингибирующие синтез ДНК;
— циклические олигопептиды (например, бацитрацин), подавляющие синтез клеточных стенок;
— линейные или циклические олигопептиды, нарушающие функции мембран — грамицидин, тироцидин В или ингибирующие синтез РНК — например,тиротрицин;
— аминогликозидные антибиотики—бутирозин.
В последние годы было достоверно установлено, что B.subtilis продуцирует такие антибиотики, как атерримин, aspergillus-фактор, бацилипин, бацилизин, бацилломиксин, бациллин, бульбиформин, глобицин, датемицин, дебариоцидин, истеидин, итурин, ксантелин, микосубтилин, микобаииллин, неоцидин, обутин, петрин, полихлоросубтилин, ризобацидин, ризостониа-фактор, субтилин, субтенолин, субтенолизин, субтилизин, субспорин, токсимицин, трипанотоксин, фунгистатин, фунгоцин, флювомицин, эндосубтилизин, эумицин, антибиотики 49- 4,6633, 26а, В-456,3, бацилломицин.
Атерримин образуется темнопигментным штаммом В.subtilis v.aterrimus. В1957 г. из культуры выделены два антибиотических вещества, близкие по природе — атерримины А и В, которые представляют собой лактоны. Атерримины А и В характеризуются выраженным антибиотическим действием на грамположительные бактерии.
Aspergillus-фактор—антибиотическое вещество, которое получил в 1949 г. Michener М. из культуры В.subtilis 6633. Природа антибиотика не изучена. В небольших концентрациях оказывает выраженное действие на различные виды грибов и дрожжей.
Субтилин был выделен из культурального фильтрата штамма В.subtilis 6633. Этот антибиотик подавляет рост ряда микроорганизмов: R.nigricans — в дозе 8,1мкг/мл; R.solani — 0,4; S.bataticola — 3,5; S.fructicola — 5,9; P.digitatum — 6,2; A.niger — 9,9; B.cinerea — 4,8мкг/мг.
Бацилипины А и В описаны в 1949 г. Эти антибиотики получены из культуры В.subtilis. Бацилипины А и В оказывают выраженное бактериостатическое действиена M.phlei, S.aureus, C.diphteriae, В.anthracis, S.enteritidis, S.typhi, E.coli.
Бацилизин — антибиотик,который также, как ибацилипины А и В, получен в 1949 г. из культуры В.subtilis. Антибиотик представляет собой пептид, содержащий аминокислоты: аланин, тирозин, лейцин, фенилаланин, серусодержащую аминокислоту. Оказывает бактерицидное действие на M.phlei, S.aureus, C.xerose, E.coli.
Бацилломиксин — антибиотический комплекс, описанный в 1951 г., представляет собой полипептид, в составе которого имеются глютаминовая и аспарагиновая аминокислоты, тирозин, серии и треонин.
Бацилломицин — антибиотик, полученный в 1947 г., характеризуется высокой избирательной активностью против патогенных грибов и дрожжей. В дозах 0,025 мкг/мл подавляет рост М.andonini, M.gypseum, T.rubrum, T.schonleini, E.floccosum, B.brasiliens, C.immitis, H.capsulatum, M.apiospormum.
Бациллин — антибиотик, полученный из культуры В.subtilis в 1946 г.
Подавляет рост грамположительных микроорганизмов (S.aureus, S.albus, S.pyogenes, S.lanceolatus) и грамотрицательных (Е.coli, S.parathyphi, Pasterellasp.). Введение бациллина мышам внутри брюшин но в дозе до 1000 мг/кг невызывает патологических изменений.
Бульбиформин выделен в 1952 г. в виде концентрата. Подавляет рост грибов,неактивен в отношении бактерий. Природа этого антибиотика неизучена.
Глобицин получен из культуры В.subtilis в 1952 г. В дозе 10 мкг/мл подавляет рост S.aureus, В.cereus, M.phlei, M.avium.
Датемицин — антибиотик, полученный в 1955 г., оказывает угнетающее действие на рост различных грибов в дозах 50-100 мкг/мл.
Дебариоцидин выделен в 1958 г. Задерживает рост некоторых видов дрожжеподобных грибов.
Истеидин—антибиотик, выделенный в 1959 г. Подавляет рост грибов и дрожжей.
Итурин синтезируется культурой В.subtilis v.ituriensis. Выделен в 1950 г.
Антибиотик подавляет рост Е.coli, S.marcescens, S.aureus, Corynebacterium. Более выраженное действие итурин оказывает на грибы, в том числе, напатогенные для человека и животных.
Ксантелин получен в 1951 г. Подавляет рост грамположительных, грамотрицательных, кислотоустойчивых бактерий. Оказывает угнетающее действие на возбудителей бруцеллеза.
Микосубтилин — антибиотик, синтезируемый культурами В.subtilis, которые продуцируют также субтилин. Микосубтилин высоко активен в отношении ряда грибов и дрожжей. В дозе 1,5 мкг/мл подавляет рост Trichophyton sp. и U.zeae, в дозе 2,5 мкг/мл — S.fructicola, в дозе 3,75мкг/мл оказывает угнетающее действие на T.delbruckii, Hansenulaanomala, в дозе 5,0 мкг/мл — нa T.cremoris, S.rosens, C.neoformans, M.audouini, R.rubra, A.schonleini.
Микобациллин выделен и описан в 1958.В дозах 0,02 мкг/мл подавляет рост A.niger, C.albicans. Успешно применяется при лечении грибковых поражений кожи. Подавляет также рост грибов — возбудителей некоторых болезней растений.
Неоцидин — антибиотический концентрат, выделенный из культуры В.subtilis в 1951 г. Характеризуется бактериологическим действием на грамположительные бактерии М.tuberculosisavium.
Обутин получен в 1951 г. И проявляет антибактериальную активность в отношении S.aureus, В.anthracis. По антибиотическим свойствам сходен с неоцидином.
Петрин — антибиотик, полученный в 1958 г. В дозах 6,7-40 мкг/мл подавляет рост N.meningitis, H.pertussis, H.parapertussis, H.ihfluenzae, N.gonorrhoeae, C.diphteriae.
Полихлорсубтилин описан в 1965 г. Действует преимущественно на грамотрицательные микроорганизмы.
Ризобацидин выделен в 1952 г. в кристаллическом виде. Представляет собой пептид, оказывающий антибиотическое действие на возбудителей заболеваний растений.
Ризостониа-фактор получен из культуры В.subtilis 6633. Описан в 1949г.
Характеризуется избирательной активностью в отношении ряда микроскопических грибов и дрожжей. Получен из водного раствора культуры, которая используется для производства субтилина. Ризостониа-фактор обладает антифунгальными свойствами. Угнетает рост Rothium sp. в дозе 270 мкг/мл, R.nigricans — 160, R.solan i— 45, S.bataticola — 64, S.fructicola —14, P.digitatum — 68, B.cinerea — 6,4мкг/мл.
Субтилин продуцируется культурой В.subtilis NRRL-B545. Характеризуется выраженным бактерицидным действием на многие, в том числе патогенные, микроорганизмы. Высокоактивен, в частности, против T.pallidum, S.aureus, В.anthracis, В.cereus, Neisseria, M.tuberculosis. Успешно применяется в пищевой промышленности как консервант, особенно в производстве консервов из скоропортящихся продуктов. Прибавление небольших доз этого антибиотика позволяет значительно уменьшить время стерилизации, что обеспечивает сохранение естественного цвета консервируемых продуктов, особенно фруктов.
Субтенолин выделен в 1948 г. Подавляет рост некоторых грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: в дозе 16,5 - 22,5 мкг/мл — Pasteureullasp.; в дозе 140-200 мкг/мл — S.aureus; 165 мкг/мл — S.typhi.
Субтилизин описан в 1945. Обладает ферментными свойствами: лизирует Е.coli, C.septicum, C.oedematiens, S.enteritidis, P asteurellasp. в дозах 20—50мкг/мл. Полученный из этой же культуры препарат анализин по своим свойствам аналогичен субтилизину.
Субспорин — комплекс антибиотических веществ, образуемых штаммом В.subtilis PCI-219. Известны субспорины А, В и С. Активность субспорина А не снижается после воздействия хемо-трипсина, пепсина или карбоксипептидазы. Проявляет высокую антибиотическую активность по отношению к некоторым видам грибов и дрожжей.
Токсимицин получен в 1952 г. в виде концентрата. Проявляет антибиотические свойства в отношении фитопатогенных грибов и В.cereus. Обладает также антивирусными свойствами.
Трипанотоксин, выделенный в 1911г., подавляет рост Spirillum и Leishmania.
Фунгистатин (синоним — антибиотик XG) описан в 1946 г. Характеризуется выраженным антибиотическим действием в отношении некоторых грибов, патогенных для человека, животных и растений. В дозах 4-10 мкг/мл подавляет рост T.gypseum, E.floccosum, Rhodotorula, M.alpicans.
Фунгоцин описан в 1952 г. По антибиотическим свойствам сходен с фунгистатином и бацилломицином. Обладает противогрибной активностью. Антибиотик не диализируется, адсорбируется на активированном угле. Не инактивируется пепсиномилитрипсином. Не растворяется в воде, эфире, хлороформе. Молекулярная масса 1100 Д.
Флювомицин (синонимы: Efsiomycin, Vivicil, Riomycin) — антибиотик, образуемый культурой В.subtilis FC-5036. Выделен в 1952 г. Наиболее выраженное действие оказывает на S.aureus, P.vulgaris, E.coli и C.albicans.
Эндосубтилизин — антибиотик, описанный в 1946 г. В дозах 1 мкг/мл подавляет рост S.aureus, в больших дозах —S.haemolyticus и M.tuberculosis.
Эумицин открыт в 1946 г. Оказывает наиболее выраженное антибиотическое действие в дозе 5 мкг/мл на C.diphteria.
Среди бактерий вида В.subtilis описаны продуценты нескольких антибиотиков, которым еще не присвоены названия. Это такие, как антибиотик 26а, антибиотикTL-119, антибиотик В-456, антибиотик 49-4, антибиотик 61-26 и антибиотик, продуцируемый штаммом В.subtilis 3.
В 1978 г. Jarosz J. опубликовал данные о полипептидном антибиотике, полученном из культуры В.subtilis 26a. Продуцент антибиотика — В.subtilis 26a – был изолирован из кишечника личинки большой восковой моли. Указанный штамм продуцирует несколько биологически активных веществ, находящихся в смеси: это полипептидный антибиотик типа бацитрацина, бактериальный фермент, характеризующийся эндо-β-N-ацетилмура-мидгликаногидролазной активностью и не идентифицированное активное вещество. Антибиотик образуется преимущественно в стационарной фазе развития культуры —в то время, когда происходит споруляция. В составе препарата обнаружено 12 остатков аминокислот, в их числе глютаминовая, изолейцин, лейцин, фенилаланин, лизин, гистидин, орнитин и цистин.
Антибиотик 26а не инактивируется сывороткой крови; не снижает активности под влиянием пепсина, трипсина, липазы. Максимальную антибиотическую активность проявляет в отношении микрококков и бацилл в дозах 0,078—0,3мкг/мл. Поспе к тру антимикробного действия антибиотик близок к пенициллину, бацитрацину и лизоциму.
В 1975 г. был выделен антибиотик TL-119, синтезируемый культурой В.subtilisTL-119, изолированной из почвы Таиланда. Молекулярная масса антибиотика TL-119 — 800 Д; он отнесен к полипептидам. В составе антибиотика определены следующие аминокислоты: фенилаланин, треонин, аланин, валин и лейцин.
Об антибиотике В-456, образуемом В.subtilis, сообщил в1956г. Tanaka. Этот антибиотик представляет собой препарат полипептидной природы и содержит d-тирозин.Обладает противогрибным действием.
Антибиотик 49-4 продуцируется культурой В.subtilis DINR-49-4. Описан в 1964 г. Получены три полипептидные фракции. Аминокислотный состав всех трех фракций оказался сходным: аспарагиновая и глютаминовая кислоты, пролин, серии, тирозин. Биологическая активность фракций различалась. Первая наиболее активна в отношении Neurosporacrassa; вторая —Penicilliumchrysogenum, третья—Trichophytontonsurans. Все три выделенные антибиотические вещества —полипептиды и отнесены к группе бацилломицина. Различаются по содержанию в них пролина.
Антибиотик 61-26 образуется культурой В.subtilis 61-26, изолированной из почв Новой Гвинеи. Описан в 1975 г. Анализ ИК-спектров показал, что антибиотик 61-26 является пептидом, содержащим лактонилиэфирную связь (предположительные данные). Молекулярная масса около 1200 Д. Содержит следующие аминокислоты: аспарагиновую, серии, валини и золейцин. Препарат 61-26 оказывает антибиотическое действие на грамположительные бактерии, некоторые грибы и дрожжи, в том числе патогенные для человека и животных.
В 1979 г. Харченко С.Н. и соавт. описали способ борьбы с плесневением кормов при использовании штамма В.subtilis 3. Этот штамм продуцирует антибиотик, подавляющий рост некоторых грибов (Stachybotrisalternans Bonordи Dendrodochiumtoxicum), а также патогенных и условно патогенных бактерий: Е.coli, P.vulgaris, Ps.aeruginosa, В.anthracis, C.albicans. Согласно предварительным данным о химической природе антибиотика, это — низкомолекулярный полипептид, в составе которого обнаружены фенилаланин, гистидин, аспарагиновая кислота. Антибиотик растворим в воде, его водные растворы стойкие.
Штамм В.subtilis 3 используется в сельском хозяйстве для борьбы с плесневением кормов, вызываемым такими грибами, как Stachybotris alternans и Dendrodochiumtoxicum. Обработка кормов (солома, сено) осуществляется аэрозольным способом с использованием суспензии культуры в разведении 500 млрд. клеток на 10 л воды. Микологическими исследованиями установлено, что при обработке культурой, например, соломы, пораженной Stachybotrisalternans, количество высеваемых из обработанного субстрата колоний гриба снижается в зависимости от продолжительности и контактами кромицета с антагонистом: через две недели - в 6 раз, через месяц — в 23-25 раз. Кроме того, у животных отмечается снижение заболеваемости желудочно-кишечными болезнями.
Таким образом, можно констатировать, что бациллы, и в первую очередь, B.subtilis, характеризуются широким спектром продуцируемых ими антибиотических веществ, обуславливающих их высокую антагонистическую активность в отношении различных микроорганизмов. Поэтому, создание препаратов на основе бацилл или их метаболитов, является принципиально новым подходом к лечению бактериальных, вирусных, грибных и смешанных инфекций.
Биосинтез бактериями рода Bacillus ферментов, аминокислот и других биологически активных веществ
По данным отечественных и зарубежных ученых бактерии рода Bacillus характеризуются полиферментативными свойствами. Клетки бацилл включают набор ферментов различных классов, что обеспечивает им возможность существовать в разнообразных субстратах.
Таблица 2
Ферменты, обнаруженные у представителей рода Bacillus
У бацилл особенно хорошо развита система гидролаз — ферментов, катализирующих реакции гидролитического расщепления молекул. Среди гидролаз практический интерес представляют протеолитические ферменты, составляющие особый подкласс пептид-гидролаз.
Основной функцией протеолитических ферментов является расщепление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными ферментами.
Внеклеточные протеазы, кроме основных функций — катализа гидролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разложении вегетативного клеточного материала для последующего использования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.
Инициация споруляции обусловлена расщеплением внеклеточной сериновой протеазой β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и превращению в РНК-полимераз у спорулирующих клеток.
Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается способностью продуцировать протеазу. Высказывается предположение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.
Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются В.subtilis и В.mesentericus.
Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и со-авт. (1974), 860 расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распространено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.
У В.subtilis и В.mesentericus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых связей фибрина.
Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на ранних этапах споруляции, раньше, чем протеазы в культуральной жидкости. Установлена тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спор у лирующих бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической посттрансляционной модификации белков.
С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, установлена их гомологичность, что подтверждает родство этих двух видов.
Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов —сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I–23000-24000Д, II—29000Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.
Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтральные порН-оптимуму их действия. Значительно реже у них обнаруживаются кислые протеазы. Наиболее известны и хорошо изучены щелочные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В (Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В.subtilis.
Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптимумом действия при рН 10,5-11,0 и температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.
В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.
Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких компонентов. По скорости движения на электрофореграммах протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из которых отнесены к субтилизинам.
Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только в виду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяйстве, медицине и ветеринарии.
Протеолитические ферменты используют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовления питательных сред; в биохимии для теоретических исследований и др.
Протеазы внедряются в ветеринарную практику и медицину для лечения воспалительных процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.
Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты. В.subtilis – это первый микроорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов. Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комплекс, состоящий из ферментов с различной субстратной специфичностью. Они делятся на две группы: ферменты, участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов.
Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.
Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для производства амилосубтилина, в животноводстве — для улучшения качества кормового белка, в медицине — в качестве антимикробных агентов, а также — в теоретических исследованиях для расшифровки структуры клеточных стенок микроорганизмов.
Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, которые можно использовать для получения глюкозы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток. Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, которая используется в пищевой промышленности.
Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и В.amyloliqulfaciens.
Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.
Практическое применение находят пектиназа — для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) — в медицине и фармацевтической промышленности.
Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок хранения ферментов и перейти к непрерывным технологическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора против белкового помутнения.
Оказалось возможным иммобилизовать не только ферменты, но и живые клетки, которые в этом состоянии способны осуществлять ферментативные реакции в течение длительного времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с сохранением иммобилизованными клетками активности α-амилазы.
Благодаря высокой биохимической активности, многообразию метаболических путей аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных токсических соединений и могут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей среды.
Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в крупномасштабном производстве. Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образуют лизин, 21,5% штаммов — фенилаланин, 7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов — триптофан.
По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus, 31 образовывал аргинин, 30 — лизин, 26 — лейцин, 26 — аспарагин.
Валин в наибольших количествах накапливается в культурах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.
Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами, что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных для гидрометаллургии условиях.
Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.
У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный белок. Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов, широко используемых в пищевой промышленности в качестве приправ, а также в медицине для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.
Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в течение 60-72 ч инозита — до 11,65 г/л, гипоксантина — до 2,05 г/л, гуанозина — до 15-16 г/л. Эти штаммы используются для получения нуклеотидов путем управляемой ферментации, в том числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.
Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis, В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В12 у бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.
Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные из ризосферы, продуцируют витамин В12 — до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.
Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов — тиамина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.
Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В6 (2-5 мг/л), рибофлавин и др.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности бактерий рода Bacillus и широком спектре синтезируемых ими веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии, медицины и ветеринарии.
Основной функцией протеолитических ферментов является расщепление белков, содержащихся в окружающей среде, и превращение их в форму, способную легко проникать внутрь клетки. В связи с этим большинство известных протеаз функционируют как экстрацеллюлярные ферменты. Большинство пептидаз являются внутриклеточными ферментами.
Внеклеточные протеазы, кроме основных функций — катализа гидролиза экзогенных белковых субстратов, принимают участие в разложении вегетативного клеточного материала для последующего использования в анаболических и катаболических реакциях. Протеазы В.subtilis играют большую роль в разрушении белковых оболочек спор во время их прорастания.
Инициация споруляции обусловлена расщеплением внеклеточной сериновой протеазой β-субъединицы РНК-полимеразы, что приводит к изменению ее матричной специфичности и превращению в РНК-полимераз у спорулирующих клеток.
Имеются данные о том, что протеазы снимают действие белковых ингибиторов споруляции. Анализ аспорогенных мутантов у представителей рода Bacillus показал, что многие из них не образуют внеклеточной протеазы и что реверсия к спорообразованию сопровождается способностью продуцировать протеазу. Высказывается предположение об участии внеклеточных протеаз в синтезе полипептидных антибиотиков.
Наиболее активными продуцентами внеклеточных протеаз являются В.subtilis и В.mesentericus.
Среди 990 штаммов рода Bacillus, исследованных Maceda-Coronels и со-авт. (1974), 860 расщепляли казеин на казеиновом агаре. У бацилл широко распространено свойство синтезировать фибринолитические ферменты.
У В.subtilis и В.mesentericus обнаружена способность растворять экспериментально вызванные у лабораторных животных тромбы кровеносных сосудов, а также гидролизовать фибриллярный белок эластин. Протеазы этих бактерий превращают фибрин в растворимую форму путем расщепления аргинил-глициновых связей фибрина.
Из клеток бацилл выделены и изучены внутриклеточные протеазы. Они появляются на ранних этапах споруляции, раньше, чем протеазы в культуральной жидкости. Установлена тесная взаимосвязь между внутриклеточными и внеклеточными протеазами спор у лирующих бактерий. Внутриклеточные протеазы способны инициировать оборот белка и принимать участие в споруляционно-специфической посттрансляционной модификации белков.
С помощью афинной хроматографии выделены в гомогенном виде внутриклеточные протеазы из В.subtilis и В.licheniformis, установлена их гомологичность, что подтверждает родство этих двух видов.
Известны протеазы бацилл преимущественно двух типов —сериновые и металлопротеазы. Так, из В.subtilis выделены две гомогенные сериновые протеазы, отличающиеся молекулярной массой: I–23000-24000Д, II—29000Д; и смесь протеаз с молекулярной массой 26000Д. В.subtilis может синтезировать одновременно металлопротеазы и сериновые протеазы.
Протеазы бактерий рода Bacillus делятся на щелочные и нейтральные порН-оптимуму их действия. Значительно реже у них обнаруживаются кислые протеазы. Наиболее известны и хорошо изучены щелочные протеазы — субтилизин А (субтилопептидаза А), субтилизин В (Novo), субтилизин BPN, выделенные из различных штаммов В.subtilis.
Из В.subtilis получена щелочная протеиназа с оптимумом действия при рН 10,5-11,0 и температуре 55°С, устойчивая к ПАВ.
В.subtilis продуцирует и нейтральные протеазы. Оптимум их действия проявляется в диапазоне рН около 7,0. Общим признаком этих ферментов является наличие ионов металлов в активном центре и действие ингибиторов типа ЭДТА.
Бациллы образуют обычно комплекс ферментов с близкими физико-химическими и каталитическими свойствами. Препараты щелочных протеаз из В.subtilis и В.licheniformis гетерогенны и состоят из нескольких компонентов. По скорости движения на электрофореграммах протеолитические компоненты препаратов разделены на шесть типов, три из которых отнесены к субтилизинам.
Протеолитические ферменты привлекают большое внимание не только в виду их распространенности и большого значения для жизни клетки, но и в связи с перспективами их применения в народном хозяйстве, медицине и ветеринарии.
Протеолитические ферменты используют в парфюмерии и косметике; в микробиологической промышленности для приготовления питательных сред; в биохимии для теоретических исследований и др.
Протеазы внедряются в ветеринарную практику и медицину для лечения воспалительных процессов, для очистки гнойных и некротических ран, ожогов, обмораживаний, для растворения тромбов и лечения некоторых опухолей. Разработаны промышленные способы получения субтилизинов, протосубтилизинов, мезентеринов, амилосубтилина.
Среди других ферментов бацилл большой интерес представляют внутриклеточные литические ферменты. В.subtilis – это первый микроорганизм, у которого была обнаружена способность лизировать не только собственные клетки, но и клетки других бактерий и грибов. Литические ферменты бацилл представляют собой сложный комплекс, состоящий из ферментов с различной субстратной специфичностью. Они делятся на две группы: ферменты, участвующие в лизисе клеточных стенок бактерий, и ферменты, лизирующие клеточные стенки дрожжей и микроскопических грибов.
Бактериолитические ферменты некоторых аэробных спорообразующих бактерий проявляют высокую активность в отношении клеточных стенок M.lysodeikticus, В.megaterium, S.aureus, P.aeruginosa, E.coli, S.typhimurium.
Литические ферменты бацилл применяются в микробиологической промышленности для производства амилосубтилина, в животноводстве — для улучшения качества кормового белка, в медицине — в качестве антимикробных агентов, а также — в теоретических исследованиях для расшифровки структуры клеточных стенок микроорганизмов.
Бактерии рода Bacillus вырабатывают α- и β-амилазы, глюкозидазы, глюкозоизомеразы, которые можно использовать для получения глюкозы, мальтозы, глюкозо-фруктозных паток. Из этих ферментов широкое промышленное применение нашла амилаза, которая используется в пищевой промышленности.
Фермент α-амилаза гидролизует α-1,4-глюконовые связи в полисахаридах и обладает активной разжижающей способностью. Этот фермент образуется культурами В.subtilis и В.amyloliqulfaciens.
Фермент β-амилаза является осахаривающим ферментом, гидролизующим крахмал с образованием мальтозы.
Практическое применение находят пектиназа — для мочки лубоволокнистых растений; пенициллиназа (β-лактамаза) — в медицине и фармацевтической промышленности.
Иммобилизация некоторых ферментов бацилл позволила во много раз увеличить срок хранения ферментов и перейти к непрерывным технологическим процессам. Например, в производстве пива используют иммобилизованную протеазу В.subtilis в качестве стабилизатора против белкового помутнения.
Оказалось возможным иммобилизовать не только ферменты, но и живые клетки, которые в этом состоянии способны осуществлять ферментативные реакции в течение длительного времени. Так, разработан способ включения клеток В.subtilis в 5%-ный акриламидный гель с сохранением иммобилизованными клетками активности α-амилазы.
Благодаря высокой биохимической активности, многообразию метаболических путей аэробные спорообразующие бактерии участвуют в биологическом разрушении чужеродных токсических соединений и могут быть использованы для борьбы с загрязнением окружающей среды.
Аэробные спорообразующие бактерии обладают способностью к повышенной экскреции свободных аминокислот в культуральную среду и могут служить источником их получения в крупномасштабном производстве. Среди выделяемых бацилл большинство штаммов (до 43%) образуют лизин, 21,5% штаммов — фенилаланин, 7% штаммов образуют цистин, метионин, гистидин; 3,5% штаммов — триптофан.
По данным Romero и соавт. (1978), из 38 исследованных штаммов рода Bacillus, 31 образовывал аргинин, 30 — лизин, 26 — лейцин, 26 — аспарагин.
Валин в наибольших количествах накапливается в культурах В.subtilis. Концентрация валина в культуральной жидкости при выращивании В.subtilis на глюкозно-солевой среде достигает 4,8 г/л.
Аминокислоты, продуцируемые бациллами, обладают золоторастворяющими свойствами, что имеет большое практическое значение для получения этого ценного металла в трудных для гидрометаллургии условиях.
Аэробные спорообразующие бактерии изучаются как возможные продуценты белка. Установлено, что белковая масса бацилл содержит все незаменимые аминокислоты, за исключением серосодержащих. Выход биомассы при выращивании в ферментере с добавками мелассы составляет 15-20 г сухого вещества на 1 л питательной среды. Биомасса при этом содержит 8-9% азота, 40% белка, до 30% поли-β-оксимасляной кислоты и 10-14% РНК.
У бацилл обнаружена способность образовывать внеклеточный белок. Бактерии рода Bacillus с 1959-60 гг. известны как продуценты пуриновых нуклеотидов, широко используемых в пищевой промышленности в качестве приправ, а также в медицине для лечения некоторых вирусных инфекций, тромбозов и др.
Селекционированы штаммы В.subtilis, продуцирующие в глюкозной среде при 30-32°С в течение 60-72 ч инозита — до 11,65 г/л, гипоксантина — до 2,05 г/л, гуанозина — до 15-16 г/л. Эти штаммы используются для получения нуклеотидов путем управляемой ферментации, в том числе многоступенчатой, а также посредством разрушения выделяемых нуклеиновых кислот.
Бациллы могут быть источником получения ингибиторов некоторых ферментов и антагонистов витаминов. Из культуральной жидкости В.amyloliquifaciens, В.polymyxa, В.subtilis, В.subtilis v.niger выделены ингибиторы глюкозидаз. Активными антагонистами витамина В12 у бацилл, в частности у В. cereus, являются пептиды.
Бациллы синтезируют витамины и выделяют их в среду. Многие штаммы, изолированные из ризосферы, продуцируют витамин В12 — до 50-60 мкг/мл. Этот витамин получают в ряде стран промышленным путем из отселекционированных штаммов бацилл.
Ростостимулирующая активность некоторых штаммов бацилл объясняется продуцированием комплекса витаминов — тиамина, пиридоксина, пантотеновой кислоты, инозита, никотиновой кислоты.
Получены мутанты В.subtilis, синтезирующие витамин В6 (2-5 мг/л), рибофлавин и др.
Приведенные данные свидетельствуют о высокой биологической активности бактерий рода Bacillus и широком спектре синтезируемых ими веществ, имеющих огромное значение для современной биотехнологии, медицины и ветеринарии.